1. Syarat-syarat :
- Pemilihan eksplan
sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, syarat –syarat tumbuhan eksplan:
1. Jaringan tersebut
sedang aktif pertumbuhanya,diharapkan masih terdapat zat tumbuh yang masih
aktif sehingga membantu
perkembangan jaringan selanjutnya
2. Eksplan yang diambil
beerasal dari bagian daun, akar, mata tunas, kuncup, ujung batang, dan umbi
yang dijaga
kelestatranya.
3. Eksplan yang diambil
dari bagian yang masih muda (bila ditusuk pisau akan terasa lunak sekali.
- Penggunaan medium yang
cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk
kultur cair.
- Pilih bagian tanaman
yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda,
ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio
bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah
kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.
2. Faktor yang menyebabkan terjadinya kontaminasi
Kontaminasi merupakan permasalahan mendasar
yang sering terjadi pada kultur in vitro. Pada kondisi media yang mengandung
sukrosa dan hara, serta kelembaban dan suhu yang relatif tinggi, memungkinkan
mikroorganisme serta spora jamur tumbuh dan berkembang dengan pesat.
Kontaminasi pada kultur in vitro dapat berasal dari:
a. Udara
b. Eksplan,
baik secara eksternal maupun internal.
c. Organisme
kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.
d. Botol
kultur serta alat-alat yang kurang steril.
e. Lingkungan
kerja dan ruang kultur yang kotor.
f. Kecerobohan
dalam bekerja.
Faktor yang menyebabkan terjadinya kontaminasi
pada media:
a. Tidak
kuatnya tutup botol. Botol ditutup menggunakan aluminium foil yang ditutup
sedemikian rupa sangat rapat agar factor-faktor penyebab kontam tidak masuk ke
dalam botol. Apabila tutup ( aluminium foil ) tidak rapat maka tidak menutup
kemungkinan terjadinya kontaminasi.
b. Media
steril yang sudah di autoclave yang di simpan beberapa hari dengan maksud untuk
melihat kontaminasi atau tidak, seringkali juga menjadi penyebab kontaminasi,
karena tempat penyimpanan yang tidak steril serta tutup botol yang tidak kuat atau
rapat.
c. Pada
saat autoclave dibuka, maka kita harus ingat bahwa kondisi lingkungan tidak
steril sehingga berpeluang masuknya kontaminasi ke dalam botol. Oleh sebab itu
maka sebaiknya membuka autoclave seharusnya diruang steril, dan tutup botol
harus segera dikuatkan kembali.
d. Terjadinya
pengerasan pada media diakibatkan kelalaian dalam proses pemasakan media yang
dilakukan secara berulang-ulang.
e. Kondisi
praktikan yang tidak aseptik, yang dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi
pada media tanam akibat dari mikroorganisme yang tersebar dan dibawa oleh
praktikan.
Faktor yang menyebabkan terjadinya kontaminasi
pada eksplan yang dikultur:
a. Pada
saat melakukan di Laminar Air Flow maka kondisi tangan tidak
boleh keluar dari tempat tersebut, dan sebelum masuk tangan harus disemprot
alcohol terlebih dahulu. Apabila terjadi kelalaian tangan tidak disemprot atau
tangan tidak sengaja keluar dari laminar saat bekerja maka tidak menutup
kemungkinan factor kontam akan masuk ke dalam.
b. Pada
saat disubkultur dan di belah-belah, maka terjadilah luka baru maka terbukalah
peluang keluarnya mikroba dari dalam sel eksplan tersebut dan akhirnya
mengontaminasi kultur tersebut.
c. Adanya
kontaminan disekeliling botol, bahkan di sekitar leher botol, maka pada saat
subkultur, bila kita tidak hati-hati maka masuklah kontaminan tersebut ke dalam
botol dan menempel pada eksplan, dan terbawa ke media yang baru.
d. Terkontaminasi
oleh media disekitar yang mengalami kontaminasi. Contohnya pada saat
pemotongan daun yang akan dikultur, pisau yang digunakan belum dalam keadaan
steril, atau cawan petri tempat pemotongan yang kurang steril.
3.
Sterilisasi eksplan dilakukan
dengan cara dicuci
menggunakan deterjen
(2g/L, 10 menit),
direndam
dalam
fungisida kontak (3 g/L, 2 jam), dan bakterisida
(3 g/L,
1 jam) yang
dilakukan di luar
LAF. Perkejaan
berikutnya dilakukan di dalam LAF,
eksplan direndam
dalam
larutan NaOCl konsentrasi 10% (v/v) dan
tween
20 (2
tetes). Lama perendaman
bervariasi bergantung
pada perlakuan.
Setelah eksplan disterilasi
kemudian
ditanam
pada media MS.
Rancangan percobaan
yang digunakan pada
penelitian ini
adalah rancangan acak
lengkap dengan
satu faktor
yaitu waktu perendaman
NaOCl 10% (v/v)
dengan 4
taraf perlakuan (5,
10, 15, dan
20 menit).
Setiap perlakuan
terdiri atas 3
ulangan, setiap ulangan
terdiri atas
10 eksplan. Total
eksplan yang digunakan
adalah
4x3x10=120 eksplan.
Pengamatan dilakukan
selama 4 minggu. Eksplan yang
telah aseptik kemudian
dipindahkan
ke media
induksi tunas. Media
yang digunakan untuk
induksi tunas
yaitu MS, MS
modifikasi (NO3
-:NH4
+
,
3:1, total
N 80 µM),
dan MS dengan
tambahan air
kelapa (CW)
150 mL/L. Rancangan
percobaan untuk
tahap
induksi tunas yang digunakan dalam
penelitian ini
adalah
rancangan acak lengkap dengan satu
faktor yaitu
komposisi media
tumbuh (MS0, MS
modifikasi,
MS+CW
15%, MS+BAP 1.5 ppm, MS modifikasi+BAP
1.5 ppm,
dan MS+CW 15%+BAP
1.5 ppm). Setiap
perlakuan terdiri
atas 3 ulangan
dan setiap ulangan
terdiri atas
5 eksplan, sehingga
total eksplan
pengamatan
berjumlah 6x3x5=90 eksplan.
Pengamatan dilakukan
selama 4 minggu
Bahan yang
digunakan antara lain
bagian tunas
(apikal atau lateral) tembesu (F. fragrans) berukuran 2
sampai dengan
3 cm, fungisida
(bahan aktif propineb
70%), bakterisida
(bahan aktif streptomicyn
sulfate
6.41%), media Murashige-Skoog (MS) (Murashige and
Skoog
1962), air kelapa (coconut water (CW)),
akuades
steril, deterjen,
alkohol 70
%, tween
20, natrium
hipoklorit (NaOCl
5.25%), dan benzilaminopurin
(BAP). Alat
yang digunakan antara
lain laminar air
flow
cabinet (LAF), botol kultur, cawan
petri, dan gelas
ukur
journal.ipb.ac.id/index.php/jsilvik/article/viewFile/9257/7265
No comments:
Post a Comment